Culture in vitro :
sortie de
Byblis filifolia

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Mise à jour : mercredi 28 avril, 2010

La culture in vitro est un moyen puissant de multiplier des plantes. Les informations sur la technique de mise en culture, avec en particulier ses phases délicates de stérilisation des spécimens, se trouve facilement mais ce n'est pas le cas pour la sortie du milieu de culture. Pourtant, c'est une étape critique .
Je vous propose de partager avec moi une tentative concernant Byblis filifolia.

© 2008 CarniBase

Les difficultés

En culture in vitro, les plantes se forment dans des milieux confinés, à 100% d'humidité. Il n'y a pas de risque de pourrissement dans la mesure où il n'y a pas de germes grâce à la stérilisation, par l'eau de Javel ou l'hypochlorite de calcium. Pour sortir les vitroplants, le nom que l'on donne aux plantes issues de cette technique, il faut donc au début les maintenir à 100% d'humidité : la plante n'a encore aucun système efficace pour empêcher l'eau de la quitter et surtout les racines - qui se sont formées dans la gélose - ne sont pas capables de la remplacer suffisamment ni d'absorber les sels minéraux présents dans le nouveau milieu. Elles doivent s'adapter durant une période plus ou moins longue. Malheureusement, cette précaution ne suffit pas toujours... Absorber des ions dissouts dans de l'eau acide n'est pas la même chose que dans cette sorte de gelée artificielle qui contient aussi des sucres, des hormones, etc. C'est un peu comme si, après une perfusion, elle n'avait plus de tube digestif et qu'elle devait le reformer.

J'ai reçu des vitroplants de Byblis filifolia encore en culture, lors d'un échange. C'est une plante peu répandue en collection. J'ai appris aussi que les transplantations directes dans le substrat avait un pourcentage de réussite quasi nul. D'après J.J. Labat entre autre, la perlite pure serait le meilleur substrat.

Tentative

L'utilisation de perlite pure oblige, plus tard, à une deuxième transplantation dans du mélange normal. Bref encore un autre choc, que j'ai cherché à éviter.
J'ai pensé qu'un mélange proche du ou identique au milieu final pouvait être meilleur mais à condition de les stériliser pour éviter pendant la phase d'adaptation une attaque rapide et le pourrissement.
J'ai donc procédé au transfert comme pour une culture in vitro mais :
- sans stérilisation des plants puisqu'ils l'étaient déjà dans la boite,
- en stérilisant par contre les milieux qui, eux, ne l'étaient pas,
- en essayant, tant qu'à faire, divers mélanges dont la perlite pure comme point de comparaison et un témoin non stérilisé.

Boite avec les Byblis in vitro

Ces plants ont été transplantés le 3 septembre depuis la boite de Pétri qui commençait à être saturée et présentait peut-être même quelques points brun-rouge au niveau des racines, signe que la plante commençait à mal réagir à son milieu. Il fallait donc le renouveller ou transplanter en pot.


Les récipients et les mélanges

Quatre pots de conserve de ménage en verre de 250 ml ont été remplis de quatre mélanges différents décrits plus bas. Quatre pots de 750 ml, plus grands, vont servir de mini-serres stériles.

LE matériel avant stérilisation

Nous voyons au centre de la photo les pots de 250 ml remplis de mélange et en périphérie les "mini-serres". Avant la stérilisation, chaque pot de mélange est posé sur le couvercle à l'envers du grand pot de 750 ml puis celui-ci est retourné lui-même par dessus le tout et vissé. Chaque récipient devient donc finalement autonome avec sa propre mini-serre en verre.

Le premier (en bas à gauche) contenait de la perlite pure neuve et bien blanche, imprégnée d'eau de pluie et qui flottait litteralement sur elle.

Le deuxième (en bas à droite) est un mélange de perlite neuve et de tourbe mais avec 100 % de perlite en haut, au contact avec les plantes et 100 % de tourbe vers le fond : si la perlite est idéale pour l'enracinement initial, il pourrait être préférable que les racines poursuivent leur croissance dans un milieu normal. Avec une telle technique, la transplantation serait ainsi évitée.

Le troisième (en haut à gauche) contenait de la perlite récupérée dans du mélange usagé. La tourbe se décompose mais la perlite reste telle quelle. Elle est donc "pure" mais elle a été en quelque sorte "vitalisée" au lieu d'être toujours le milieu inerte, un peu agressif et même abrasif : c'est un polissant de dentifrice ! J'ai pensé que les racines auraient plus de facilité pour s'accrocher, être stimulées... J'ai utilisé de l'eau de tourbe pour l'humidifier, obtenir un pH acide et compenser un peu les traces de tourbe décomposées, au pH douteux.

Le quatrième (en haut à droite) était un mélange classique homogénéisé de vermiculite/tourbe au 1/3 à 1/2 (pifomètre).

La stérilisation


Cocotte-minutte avant la stérilisation

Les quatre montages ont été placés dans une cocotte-minutte contenant quelques centimètres d'eau de pluie pendant une demi-heure pour être stérilisés.
Trois pots remplissaient le fond et le quatrième était dessus.
L'ébullition fait beaucoup vibrer tout ça et il y a risque de casse : il faut tout séparer par des chiffons.

Pots inondés

Je pensais que ce ne serait pas bien grave si un peu d'eau rentrait dans les pots retournés puisqu'elle était non calcaire et qu'il y avait un deuxième pot à l'intérieur.
En réalité, il y a eu un phénomène d'aspiration au refroidissement qui a inondé complètement les trois bocaux du bas, comme on peut le voir sur la photo où seul le récipient contenant la perlite pure (en bas à droite) ne s'est pas rempli - on voit des gouttelettes de condensation. J'ai dû arranger tout ça et recommencer.

Cette fois, il y avait trois pots vides en bas et les trois derniers pots à stériliser en haut, qui sont donc restés intacts.

Dispositif de transplantation

Un principe très ancien de microbiologie consiste à réaliser un maximum de manipulations près d'une source de chaleur qui empêche, par le mouvement de convexion de l'air, le dépôt des spores. La chaleur elle-même a des effets antiseptiques. L'air chaud, en remontant, maintient les germes en suspension, ils ne peuvent contaminer alentour. Un simple réchaud à gaz de cuisine est une source convenable de chaleur.

La construction du dispositif est précisément décrite ci-dessous. Il sera finalement placé au-dessus du réchaud et ne doit donc présenter aucun matériau combustible, d'où l'emploi exclusif du métal et de laine de roche.

Vue d'ensemble du dispositif

Le dispositif est un trépied muni d'une boite à mi-hauteur que l'on peut régler plus ou moins haut en la faisant glisser en force. Elle est réalisée avec les matériaux les plus communs qui soient : tige d'aluminium et grande boite de conserve ! Je ne voulais pas non plus passer trop de temps sur ce bricolage mais proposer un montage simple à réaliser par tous, sans matériau couteux. Un trépied garantit la stabilité : avec quatre pieds il n'y en a toujours un trop long ou trop court...

Pour le trépied, j'ai utilisé les bordures en aluminium qui protègeaient les cotés des voitures et que j'avais depuis très longtemps sans vraiment leur trouver d'utilisation, à part vaguement de tuteur. Cela ne se trouve plus beaucoup, peut-être, mais c'est facile à remplacer par autre chose, dans un matériau incombustible et pliable, tôle repliée, tube, etc.

Pour fixer les trois pieds au sommet, j'ai pensé d'abord à du fil de fer mais cela aurait glissé, l'ajustage aurait été délicat et difficile à refaire, si nécessaire. Peut-être un collier de serrage à vis aurait pu convenir aussi mais les diamètres disponibles sont en général trop grands...
J'ai tenté un simple pliage au feeling et ça marche !
Un premier brin de 51 + 7 cm a été plié de manière à former comme un crochet et le deuxième brin, qui mesurait donc pratiquement le double (soit 2 X 51) a été plié en deux ce qui donne les deux pieds restants. Cela tient tout seul. La boite (décrite ci-dessous) ajoutée ensuite par le bas sert de statif mais force aussi les pieds à s'écarter et l'ensemble devient donc autoblocant, démontable, rêglable et très efficace ;-). Tout cela sans aucune attache, vis, etc. qui auraient été difficile à fixer.

Le statif qui maintient l'ensemble est le bas d'une grosse boite de conserve (Ø 15,5 cm) plus exactement les quelques centimètres du fond. (Voir attentivement la photo plus haut.)
Le fond a été percé de trois trous disposés en triangle contre le bord, allongés pour y faire passer les pieds. Pour les faire glisser au travers, il faut obligatoirement les désolidariser momentanément mais le système de blocage qui les réuni au sommet est facile à défaire et remettre. Les trois bras sont finalement réunis définitivement. La partie cylindrique de la boite a été légèrement pliée et aplatie un peu en forme de triangle : les pieds peuvent être écartés un peu plus et l'ensemble est encore plus solide et stable.

Comme on peut le voir, j'ai découpé l'intérieur de la boite une deuxième fois pour créer une zone centrale isolée par trois ponts de tôle. L'air chaud peut ainsi remonter le dispositif et traverser la boite par les trois grandes ouvertures. Le dessin initial ressemble au symbole bien connu "radioactif". Il a été tracé d'abord au marqueur sur la tôle puis découpé avec quelques coup de meuleuse d'angle. Six coups pour les "rayons" et trois autre pour la zone centrale. Au lieu de retirer les trois languettes de tôle en excès, j'ai préféré les replier contre le bord cylindrique. A cause de leur largeur importante, je les ai chacune divisées en deux avec trois coups de meuleuse supplémentaire (voir agrandissement de la photo).

En pratique, il est plus simple de commencer par toutes les neuf découpes en rayon et de finir par la zone centrale. Celle-ci est finie à la lime pour lui donner son arrondi mais ce n'est pas obligatoire.
Tous les bords coupés sont de vrais lames de rasoir : ils doivent absolument être passés au papier de verre fin (ou à la toile émeri). Il ne faut pas appuyer directement avec le doigt l'abrasif car il risque lui-même se couper. Vous risquez tout simplement de vous trancher au mieux la peau au pire les nerfs et tendons. C'est un accident domestique fréquent à ne pas prendre à la légère...

On comprends que le centre sera donc stérile mais risquera un échauffement rapide. J'ai donc placé sur le gaz un tapis épais de laine de roche, très facile à obtenir : chute de bricolage, reste de chantier, etc.

La transplantation

Les pots sont dévissés et prêts à être ouvert au dernier moment.
La boite de Pétri est ouverte au-dessus de la tour, juste le temps de retirer deux ou trois plants avec un peu de gélose du milieu, en maintenant le couvercle au-dessus pour éviter les retombées de spores.

Les plants sont placés au centre de la boite et débarassés d'un maximum de gélose. J'ai essayé de faire cela avec une pince brucelle stérilisée à la flamme mais j'ai pas mal galéré. Les plants sont très entrelassés (photo plus haut) et il est difficile de les séparer sans écraser les tissus si fragiles... Normalement, on passe sous l'eau courante et la gélose se sépare toute seule mais j'aurais perdu l'aseptie du plant. A la rigueur, j'aurais pu profiter de la stérilisation générale pour traiter aussi un récipient avec de l'eau acide propre et remuer carrément les plants dedans mais il s'agit quand même d'un premier essai...

Byblis juste transplantés

Dès que les plants sont débarrassés de leur gélose, le grand bocal de destination est ouvert en enlevant le dessus en verre près de la flamme. L'ensemble "couvercle du bas - pot - mélange" est alors placé juste sur la laine de roche, qui ne chauffe que très peu, pas assez pour poser vraiment un problème aux plants - mais un peu au doigts quand même car ils se trouvent autour de la laine de verre, en plein dans l'air chaud ascendant...

Byblis transplantés, dans leur mini-serre

Les plants sont positionnés rapidement. Pas évident du tout à réaliser, surtout dans la perlite pure : elle n'a aucune tenue (on ne peut pas vraiment creuser pour rempoter) et elle adhère aux plants au moindre contact. Sans parler des poils bien collants qui recouvrent les feuilles... Bref, long quand même, chaud aussi dans tout les sens du terme ;-) Plus les poses-photos pour ce petit reportage ;-)

Les bocaux ont été placés à l'extérieur, esposés au nord d'un mur : lumière intense naturelle du ciel mais pas de soleil direct. Le mieux aurait été des conditions parfaitement contrôlées surtout au niveau de la température.

Les derniers plants de la boite de Pétri ont été transplantés dans du mélange classique vermiculite/tourbe, recouverts du couvercle de leur boite : les plants sont aussi plats que celle-ci ! L'ensemble a été placé dans un terrarium, non chauffé actuellement, et dans lequel je réalise beaucoup de boutures.

Résultats et conclusion

Les plants placés dans le milieu non stérile se sont liquéfiés en quelques jours !

Au bout de quinze jours, il n'y avait pas vraiment eu de problème pour les autres, si ce n'est deux ou trois "spots" d'une moisissure blanche (inconnue) vite retirée (en condition stérile de nouveau). Les mini-serres en verre reçoivent beaucoup de condensation et il n'est pas facile de surveiller. Il existe des produits antibuées pour les parebrise, plus ou mpoins déperlants, et peut-être qu'ils auraient pu être utiles...

Au bout d'un mois, j'ai placé les bocaux dans ma serre, pour les habituer à leur lieu de vie final. Quelques traces de soleil mais à travers la toile ombrée de blanc pour l'été...

Au bout de six semaines, délais normal pour une adaptation, tout se passait bien. Les plantes étaient saines, pas de différence notable selon les substrats et des jeunes pousses repartaient. Très peu de brunissement.

J'ai tenté une" vraie" sortie en enlevant enfin les couvercles qui recouvraient les pots, eux-mêmes donc placés à l'air libre dans la serre pendant une journée, après un traitement fongicide préventif au Benlate.
J'ai alors signalé la sortie réussie de l'in vitro par cette méthode.

Pendant les quelques jours suivants, j'ai été moins attentif aux plantes et réalisé trop tard que pas mal de plantes brunissaient, surtout les parties qui n'avaient pas repris. Il aurait fallu que je coupe toutes les zones suspectes mais j'ai été encore occupé et préféré refermer les bocaux pour replacer les plantes dans le milieu pour lequel elles s'étaient adaptées.

J'ai finalement réouvert tout ça, enlevé tout ce qui était mort et il ne restait environ que 20 % en survie ;-(
Actuellement tout a disparu ;-(.

Tout cela m'a permis d'acquérir un début d'expérience en la matière, un matériel réutilisable et ne compromet pas l'efficacité de la méthode : il aurait fallu une surveillance plus importante de la température pour ce genre de plante ou tout simplement le réaliser en plein été. En dehors de bouturages hivernés comme ceux pratiqués pour les Rosiers, la température conseillée pour la plupart des bouturages est d'environ 25 °C. La lumière doit aussi être intense avec une durée importante. Le mois de septembre était donc inapproprié.

Les quatre mélanges ne semblent pas montrer de différence mais l'interruption de la croissance n'a pas permi de comparaisons significatives : c'est ce que je regrette le plus.

Hervé Huet, qui m'a procuré les plants, a dans la même période réalisé une sortie de l'in vitro dans des conditions non stériles mais en ambiance artificielle (température et lumière). Un seul plant a résisté. Il a été transplanté ensuite avec sa motte de perlite dans un pot plus grand avec un mélange 50-50 de perlite et tourbe. Des branches latérales qui avaient manifestées un retour de croissance ont été tronçonnées en brins de 3 cm pour être bouturées dans le même mélange. Le résultat est remarquable car tout a pris avec une grande facilité !
Il semble donc que, outre la température à maintenir vers 25°C, le problème majeur vienne des racines trop adaptées au milieu artificiel. Les tissus jeunes, comme ceux de branches récentes, ont chez la plupart des plantes de fortes capacités à former des racines et en voici encore la démonstration : il est donc inutile et même nuisible de chercher absolument à conserver les anciennes.

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